Uso e precauções do tubo de centrífuga de ultrafiltração
1) Escolha um tubo de ultrafiltração adequado.Observe que as membranas UF diferem em seu nível de tolerância a vários produtos químicos.Tipicamente, os tubos de ultrafiltração com um limite de peso molecular de 10 kDa podem ser selecionados com um limite de peso molecular que não deve ser superior a 1/3 do peso molecular da proteína de interesse, tal como 35 kDa.Se o peso molecular da proteína de interesse for em torno de 10 kD, um tubo de ultrafiltração com corte de peso molecular de 3 KD pode ser usado.
(2) A ultrafiltração, recém adquirida, é seca, com água ultrapura adicionada antes do uso e água passada completamente pela membrana, banho de gelo ou geladeira pré-resfriada por alguns minutos.A água é então despejada, ou seja, o líquido protéico, e a quantidade adicionada, o que não for maior que a linha branca no topo do tubo.A operação é leve e o tubo de ultrafiltração precisa ser pré-resfriado em gelo antes de adicionar a solução proteica.
3) Tanto a massa quanto o centro de gravidade deveriam atingir o equilíbrio.Observe que a velocidade de rotação e a aceleração não são muito rápidas, caso contrário danificam diretamente a membrana de ultrafiltração.A ultrafiltração centrífuga foi iniciada (centrífuga pré-resfriada a 4 graus).Depois que o RPM de diferentes centrífugas foi convertido para g, ele ficou diferente.A aceleração da centrífuga foi ajustada ao mínimo, reduzindo a pressão na membrana.Observe, certifique-se de deixar a centrífuga depois que ela atingir a velocidade de destino ou, se tiver um problema, não conseguirá manuseá-la pela primeira vez.A orientação da membrana ao fuso foi ajustada de acordo com as instruções (a caixa angular da centrífuga é a membrana ao eixo perpendicular).Na utilização prática, a velocidade geral de rotação é inferior à indicada nas instruções, para que a vida útil do tubo centrífugo possa ser prolongada.
3) Tanto a massa quanto o centro de gravidade deveriam atingir o equilíbrio.Observe que a velocidade de rotação e a aceleração não são muito rápidas, caso contrário danificam diretamente a membrana de ultrafiltração.A ultrafiltração centrífuga foi iniciada (centrífuga pré-resfriada a 4 graus).Depois que o RPM de diferentes centrífugas foi convertido para g, ele ficou diferente.A aceleração da centrífuga foi ajustada ao mínimo, reduzindo a pressão na membrana.Observe, certifique-se de deixar a centrífuga depois que ela atingir a velocidade de destino ou, se tiver um problema, não conseguirá manuseá-la pela primeira vez.A orientação da membrana ao fuso foi ajustada de acordo com as instruções (a caixa angular da centrífuga é a membrana ao eixo perpendicular).Na utilização prática, a velocidade geral de rotação é inferior à indicada nas instruções, para que a vida útil do tubo centrífugo possa ser prolongada.
(4) Quando concentrado no 1ml restante, pegue 50ul de solução tampão, adicione 10ul de fluxo e veja se há alguma cor azul, para avaliar se falta proteína no tubo de ultrafiltração.Se o tubo apresentar vazamento, despeje novamente a camada superior e flua para um novo tubo para iniciar a ultrafiltração.Para determinar com precisão se os tubos foram perdidos, centrifugue por 10 minutos com 5mgml de BSA antes do fluxo, executando em cola de proteína ou ensaio bruto de Bradford, e continue adicionando a solução de proteína concentrada restante (que opera em gelo e evita o aquecimento das proteínas) até todo o concentrado foi adicionado.Tome cuidado durante a centrifugação se ocorrer precipitação de proteínas, levando ao fechamento do tubo.Se ocorrer precipitação, determine se a causa específica da precipitação é uma concentração excessiva de proteínas ou um tampão inadequado;O primeiro pode ser resolvido por ultrafiltração de múltiplos tubos de ultrafiltração simultaneamente, diminuindo a concentração, e o último pela troca de diferentes soluções tampão até que não ocorra precipitação da proteína.
(4) Quando concentrado no 1ml restante, pegue 50ul de solução tampão, adicione 10ul de fluxo e veja se há alguma cor azul, para avaliar se falta proteína no tubo de ultrafiltração.Se o tubo apresentar vazamento, despeje novamente a camada superior e flua para um novo tubo para iniciar a ultrafiltração.Para determinar com precisão se os tubos foram perdidos, centrifugue por 10 minutos com 5mgml de BSA antes do fluxo, executando em cola de proteína ou ensaio bruto de Bradford, e continue adicionando a solução de proteína concentrada restante (que opera em gelo e evita o aquecimento das proteínas) até todo o concentrado foi adicionado.Tome cuidado durante a centrifugação se ocorrer precipitação de proteínas, levando ao fechamento do tubo.Se ocorrer precipitação, determine se a causa específica da precipitação é uma concentração excessiva de proteínas ou um tampão inadequado;O primeiro pode ser resolvido por ultrafiltração de múltiplos tubos de ultrafiltração simultaneamente, diminuindo a concentração, e o último pela troca de diferentes soluções tampão até que não ocorra precipitação da proteína.
(5) As primeiras etapas são usadas para concentrar a proteína e, se o tampão for trocado, adicione suavemente um novo tampão (ultrafiltração através de uma membrana de ultrafiltração de 0,22um) a cerca de 1ml de proteína total e reconcentre-se a cerca de 1ml por três vezes consecutivas, com o volume final concentrado dependendo da concentração de proteína desejada, geralmente não superior a 500ul, mas também dentro de 200ul.Alcançar 1000 × ou mais em três ocasiões, essencialmente a mesma quantidade de mudança de buffer, calculada por pelo menos 10 × ou mais enriquecimento de volume de cada vez.
(5) As primeiras etapas são usadas para concentrar a proteína e, se o tampão for trocado, adicione suavemente um novo tampão (ultrafiltração através de uma membrana de ultrafiltração de 0,22um) a cerca de 1ml de proteína total e reconcentre-se a cerca de 1ml por três vezes consecutivas, com o volume final concentrado dependendo da concentração de proteína desejada, geralmente não superior a 500ul, mas também dentro de 200ul.Alcançar 1000 × ou mais em três ocasiões, essencialmente a mesma quantidade de mudança de buffer, calculada por pelo menos 10 × ou mais enriquecimento de volume de cada vez.
Horário da postagem: 09 de novembro de 2022