PCR, é a reação em cadeia da polimerase, que se refere à adição de dNTP, Mg2+, fatores de alongamento e fatores de aumento de amplificação ao sistema sob a catálise da DNA polimerase, usando o DNA parental como modelo e primers específicos como ponto de partida da extensão, Através das etapas de desnaturação, recozimento, extensão, etc., o processo de replicação in vitro de DNA de fita filha complementar ao DNA modelo de fita parental pode amplificar rápida e especificamente qualquer DNA alvo in vitro.
1. PCR de início quente
O horário de início da amplificação no PCR convencional não é colocar a máquina de PCR na máquina de PCR, e então o programa começa a amplificar.Quando a configuração do sistema é concluída, a amplificação começa, o que pode causar amplificação inespecífica, e a PCR de inicialização a quente pode resolver esse problema.
O que é PCR de início a quente?Após a preparação do sistema de reação, o modificador enzimático é liberado em alta temperatura (geralmente superior a 90°C) durante o estágio inicial de aquecimento da reação ou estágio de “início a quente”, para que a DNA polimerase seja ativada.O tempo exato de ativação e a temperatura dependem da natureza da DNA polimerase e do modificador de início a quente.Este método utiliza principalmente modificadores como anticorpos, ligantes de afinidade ou modificadores químicos para inibir a atividade da DNA polimerase.Como a atividade da DNA polimerase é inibida à temperatura ambiente, a tecnologia de inicialização a quente oferece grande conveniência para a preparação de múltiplos sistemas de reação de PCR à temperatura ambiente, sem sacrificar a especificidade das reações de PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR de transcrição reversa) é uma técnica experimental para transcrição reversa de mRNA em cDNA e seu uso como modelo para amplificação.O procedimento experimental é extrair primeiro o RNA total em tecidos ou células, usar Oligo (dT) como primer, usar transcriptase reversa para sintetizar cDNA e, em seguida, usar cDNA como modelo para amplificação por PCR para obter o gene alvo ou detectar a expressão gênica.
3. PCR quantitativo fluorescente
PCR quantitativo fluorescente (PCR quantitativo em tempo real,RT-qPCR) refere-se ao método de adição de grupos fluorescentes ao sistema de reação de PCR, utilizando o acúmulo de sinais fluorescentes para monitorar todo o processo de PCR em tempo real e, finalmente, utilizando a curva padrão para analisar quantitativamente o modelo.Os métodos qPCR comumente usados incluem SYBR Green I e TaqMan.
4. PCR aninhado
Nested PCR refere-se ao uso de dois conjuntos de primers de PCR para duas rodadas de amplificação por PCR, e o produto de amplificação da segunda rodada é o fragmento do gene alvo.
Se uma incompatibilidade do primeiro par de iniciadores (iniciadores externos) fizer com que um produto não específico seja amplificado, a possibilidade da mesma região não específica ser reconhecida pelo segundo par de iniciadores e continuar a amplificar é muito pequena, então o amplificação pelo segundo par de primers, a especificidade da PCR foi melhorada.Uma vantagem de realizar duas rodadas de PCR é que isso ajuda a amplificar produto suficiente a partir de DNA inicial limitado.
5. PCR de pouso
Touchdown PCR é um método para melhorar a especificidade da reação de PCR ajustando os parâmetros do ciclo de PCR.
Na PCR de touchdown, a temperatura de recozimento para os primeiros ciclos é definida alguns graus acima da temperatura máxima de recozimento (Tm) dos primers.A temperatura de recozimento mais alta pode efetivamente reduzir a amplificação não específica, mas, ao mesmo tempo, a temperatura de recozimento mais alta agravará a separação de primers e sequências alvo, resultando em rendimento de PCR reduzido.Portanto, nos primeiros ciclos, a temperatura de recozimento é geralmente ajustada para diminuir 1°C por ciclo para aumentar o conteúdo do gene alvo no sistema.Quando a temperatura de recozimento é reduzida para a temperatura ideal, a temperatura de recozimento é mantida para os ciclos restantes.
6. PCR direto
PCR direto refere-se à amplificação do DNA alvo diretamente da amostra, sem a necessidade de isolamento e purificação de ácido nucleico.
Existem dois tipos de PCR direto:
método direto: pegue uma pequena quantidade de amostra e adicione-a diretamente ao PCR Master Mix para identificação por PCR;
método de craqueamento: após a amostragem da amostra, adicione-a ao lisado, lise para liberar o genoma, pegue uma pequena quantidade do sobrenadante lisado e adicione-o ao PCR Master Mix, realize a identificação por PCR.Esta abordagem simplifica o fluxo de trabalho experimental, reduz o tempo prático e evita a perda de DNA durante as etapas de purificação.
7. PCR SOE
O splicing de genes por PCR de extensão de sobreposição (SOE PCR) utiliza primers com extremidades complementares para fazer com que os produtos de PCR formem cadeias sobrepostas, de modo que na reação de amplificação subsequente, através da extensão das cadeias sobrepostas, diferentes fontes de uma técnica em que os fragmentos amplificados são sobrepostos e emendados.Esta tecnologia tem atualmente duas direções principais de aplicação: construção de genes de fusão;mutação genética dirigida ao local.
8. IPCR
A PCR inversa (IPCR) utiliza primers complementares reversos para amplificar fragmentos de DNA diferentes dos dois primers e amplifica sequências desconhecidas em ambos os lados de um fragmento de DNA conhecido.
O IPCR foi originalmente projetado para determinar a sequência de regiões desconhecidas adjacentes e é usado principalmente para estudar sequências promotoras de genes;rearranjos cromossômicos oncogênicos, como fusão, translocação e transposição de genes;e integração de genes virais, também são comumente usados agora. Para mutagênese dirigida ao local, copie um plasmídeo com a mutação desejada.
9.dPCR
PCR digital (dPCR) é uma técnica para quantificação absoluta de moléculas de ácido nucleico.
Existem atualmente três métodos para a quantificação de moléculas de ácido nucleico.A fotometria baseia-se na absorvância das moléculas de ácido nucleico;PCR quantitativo fluorescente em tempo real (PCR em tempo real) é baseado no valor Ct, e o valor Ct refere-se ao número do ciclo correspondente ao valor de fluorescência que pode ser detectado;PCR digital é a mais recente tecnologia quantitativa baseada no método PCR de molécula única para contagem de ácidos nucleicos, a quantificação é um método quantitativo absoluto.
Horário da postagem: 13 de junho de 2023